Инициатором строительства выступил купец Трофим Петрович Козлов, который на собственные средства финансировал возведение храма.Закладку церкви совершил епископ Уфимский и Мензелинский Дионисий (Хитров) в присутствии уфимского губернатора.
Строительство храма велось ускоренными темпами, и уже 22 августа 1893 года состоялось его освящение в честь Воздвижения Животворящего Креста Господня. Первым настоятелем церкви стал протоиерей Николай Алексеевич Котельников. Вскоре после открытия храма численность прихода значительно возросла, что обусловило необходимость расширения здания. В 1902 году к основному объёму были пристроены два придела: северный — во имя святителя Николая Чудотворца и южный — во имя святых апостолов Петра и Павла, в результате чего храм стал трёхпрестольным.
Архитектурно здание представляет собой образец деревянного русского стиля, характерного для церквей конца XIX — начала XX века. Сооружение выполнено из брёвен, соединённых «в лапу», и обшито тёсом. Фасады окрашены в белый цвет с жёлтыми элементами отделки, крыша и купола — голубого цвета. Храм увенчан семью куполами, кресты на которых изготовлены из зеркального стекла, вставленного в чугунные рамки. Внутреннее убранство включает резной четырёхъярусный иконостас с иконами, выполненными в древневизантийском стиле.
Приход Крестовоздвиженской церкви активно занимался образовательной и благотворительной деятельностью. В 1902 году по инициативе протоиерея Николая Котельникова при храме было открыто первое в Уфимской губернии училище для глухонемых детей, финансируемое за счёт благотворительных пожертвований. Здание училища, расположенное по адресу ул. Лесопильная, 4, было освящено 18 августа 1902 года.
В период 1920–1930-х годов храм оставался действующим, однако в 1937 году был закрыт, а здание использовалось под склады и общежитие. В годы Великой Отечественной войны, в 1942 году, богослужения в церкви были возобновлены. В последующие десятилетия Крестовоздвиженская церковь оставалась одной из немногих функционирующих в Уфе.
В 1998 году при храме был открыт Уфимский центр дистанционного обучения Православного Свято-Тихоновского богословского института. В настоящее время при приходе действуют различные образовательные и социальные проекты, включая воскресные школы для детей и взрослых, социальный приют для бездомных мужчин, а также иконостасная мастерская. Ежегодно организуются миссионерские сплавы по рекам Башкортостана.
