В 1814 году уфимский купец Данила Степанович Жульбин инициировал строительство каменного храма на месте прежних деревянных церквей. Строительство велось в стиле русского классицизма и было завершено в 1817 году. В этом же году был освящён придел во имя Святителя Николая. Однако в 1821 году произошёл пожар, повредивший здание, после чего потребовалась реконструкция. В 1823 году были освящены главный храм и восстановленный после пожара придел.
В 1870-х годах мастер Флегонт Королёв изготовил для храма барочный иконостас, за который был удостоен награды Императорской Академии художеств. В храме также хранились старинные иконы, включая икону Покрова Пресвятой Богородицы и икону Спаса Нерукотворного образа, написанную уфимским художником Анатолием Петровичем Лежнёвым.
В 1941 году, в период антирелигиозной политики советского государства, Покровская церковь была закрыта. Здание использовалось под аптечный склад. В 1957 году храм был возвращён верующим, и в нём возобновились богослужения.
В апреле 2004 года в храме было зафиксировано мироточение иконы преподобномученицы великой княгини Елисаветы. Икона была перенесена в алтарь по благословению архиепископа Уфимского и Стерлитамакского Никона.
В 2017 году Покровская церковь отметила 200-летие со дня постройки нынешнего здания. К этому времени были проведены работы по ремонту кровли и фасада храма.
