Первое упоминание о церкви Святителя Николая в Подкопаях датируется 1493 годом. В этот период, после разрушительного пожара в Кремле, великий князь Иван III временно проживал вблизи этого храма. Название «Подкопаи» имеет несколько версий происхождения. Одна из них связывает его с глиняными карьерами, существовавшими в этой местности, другая — с преданием о подкопе под храм с целью кражи церковных ценностей.
Каменное строительство храма, вероятно, началось в середине XVI века, о чём свидетельствуют реставрационные исследования, выявившие использование «грозненского маломера» — тонкого кирпича, характерного для эпохи Ивана Грозного. К 1657 году церковь уже упоминается как каменная. В 1686 году при храме было устроено кладбище.
В XVIII веке храм претерпел значительные изменения. В 1731 году, на средства вдовы графа Андрея Матвеева Анастасии Ермолаевны, была осуществлена его перестройка. После пожара 1748 года, в 1750 году, купец Алексей Губин финансировал обновление Казанского придела. В 1759 году была возведена существующая колокольня. К концу XVIII века в храме имелись три престола: в честь Казанской иконы Божией Матери, святителя Николая Чудотворца и святой мученицы Екатерины.
В 1812 году, во время Отечественной войны, церковь пострадала от действий французских войск. После разорения храм был приписан к Иоанно-Предтеченской церкви Ивановского монастыря и частично восстановлен. В 1855 году церковь была передана под Александрийское патриаршее подворье. Восстановительные работы проводились по проекту архитектора Николая Козловского при поддержке московских купцов Николая Каулина и Алексея Шевелкина. В этот период были обновлены иконостасы, выполнены новые росписи и приобретена церковная утварь.
В 1874 и 1889 годах храм вновь подвергался обновлениям на средства потомственного почётного гражданина Алексея Расторгуева. В 1885 году, по инициативе настоятеля подворья архимандрита Геннадия, была построена часовня в честь святителя Николая Чудотворца, освящённая в 1887 году.
В 1929 году храм был закрыт советскими властями. Здание использовалось под различные нужды: вначале как жилые помещения, затем, до 1990 года, как инструментальный цех завода «Полиэтилен». В этот период интерьеры храма были уничтожены, настенные росписи закрашены, а внутреннее пространство разделено на два этажа.
