В начале XV века, между 1407 и 1417 годами, великий князь Василий I Дмитриевич основал деревянную церковь во имя святого князя Владимира на территории своего загородного дворца. Этот дворец, окружённый роскошными садами, располагался в местности, известной как Кулишки, в районе слияния Москвы-реки и Яузы. Сады, разбитые на склонах холма, дали название храму — «в Старых Садех».
В 1514 году великий князь Василий III поручил итальянскому архитектору Алевизу Фрязину возвести на месте деревянной церкви каменный храм. Строительство было завершено в 1516 году, и новый храм стал частью великокняжеской резиденции.
В конце XVII века, в период с 1677 по 1689 годы, храм был полностью перестроен. Новое здание сохранилось до наших дней, хотя в последующие века оно подвергалось различным изменениям и реставрациям. В частности, после пожаров 1737 и 1812 годов храм восстанавливался, а в конце XVIII века была надстроена колокольня.
В XIX веке храм претерпел значительные изменения: были срублены кокошники, и здание получило четырёхскатную крышу.
В 1933 году храм был закрыт советскими властями, а в 1937 году начался его разбор. Были разрушены пять глав, уничтожено внутреннее убранство. Здание передали Государственной публичной исторической библиотеке, которая использовала его для хранения книг. В 1980 году в здании произошёл пожар, уничтоживший книги и остатки росписей на стенах.
В 1990 году, после завершения реставрационных работ, храм был передан Русской Православной Церкви. В 1991 году в отреставрированном храме состоялась первая литургия после длительного перерыва. В 1998 году возобновились богослужения в приделе благоверных князей Бориса и Глеба.
В настоящее время при храме действуют воскресная школа, православная гимназия, детский сад, школа церковного пения, учебная столярная мастерская, благотворительное братство во имя равноапостольного князя Владимира и издательство.
