Обитель была основана в конце XVI века на месте подвижничества преподобного Нила Столобенского и с тех пор прошла через множество исторических этапов, включая периоды расцвета, упадка и возрождения.
Преподобный Нил Столобенский родился в конце XV века в Жабенском погосте Новгородской земли. После принятия монашества в Крыпецком монастыре близ Пскова, он удалился в уединение, сначала в леса у реки Серемхи, а затем, в 1528 году, на остров Столобный на озере Селигер. Там он провёл 27 лет в строгом отшельничестве, посвятив себя молитве и аскезе. Преподобный Нил скончался 7 декабря 1555 года и был погребён на острове, где позже возник монастырь .
В 1594 году иеромонах Герман, ранее инок Николаевского Рожковского монастыря, с благословения патриарха Иова основал на острове монастырь, названный в честь преподобного Нила. Первоначально была построена деревянная церковь Богоявления Господня с приделом во имя Василия Блаженного. Герман также инициировал составление жития преподобного Нила, передав собранные сведения иноку Филофею Пирогову, который и написал житие .
В 1610 году монастырь был разорён во время литовского нашествия. Однако обитель была восстановлена и продолжила своё развитие. В XVIII—XIX веках монастырь пережил период расцвета: были построены каменные здания, включая Богоявленский собор, строительство которого началось в 1671 году и завершилось в 1833 году. Собор стал одним из крупнейших храмов Верхневолжья и оказал влияние на архитектуру региона .
К началу XX века Нило-Столобенская пустынь стала одним из самых посещаемых монастырей России, ежегодно принимая тысячи паломников. В монастыре проживало до 1000 насельников, действовали больница, хозяйственные и ремесленные мастерские .
После Октябрьской революции 1917 года монастырь подвергся репрессиям: в 1919 году были вскрыты мощи преподобного Нила, церковные ценности изъяты, а обитель разграблена. Монастырь продолжал существовать до 1927 года, после чего был закрыт, а его здания использовались для различных нужд: трудовая коммуна, колония для малолетних преступников, лагерь для польских военнопленных, госпиталь, дом престарелых и турбаза .
В 1990 году комплекс Нило-Столобенской пустыни был возвращён Русской Православной Церкви. В 1995 году в монастырь были возвращены мощи преподобного Нила. С тех пор ведутся работы по восстановлению обители, включая реставрацию храмов и монастырских зданий .
