Владимирский храм был построен в 1809–1811 годах. При нём изначально действовал монастырский лазарет: рядом с церковью располагались больничные кельи для монахов, а внутри храма круглосуточно читались молитвы о здравии братии. Эта однопрестольная церковь была освящена в честь Владимирской иконы Пресвятой Богородицы. После 1918 года Владимирская церковь, как и другие храмы Оптиной, была закрыта. В послевоенные годы её здание разобрали до основания, и святыня исчезла с лица земли. Лишь в конце XX века, при возрождении обители, археологи обнаружили фундамент утраченного храма на прежнем месте. В 1998 году Владимирский храм был заново отстроен и торжественно освящён, вернувшись на своё историческое место.
Ныне Владимирский храм служит усыпальницей прославленных оптинских старцев. В июле 1998 года при раскопках были обретены мощи семи преподобных старцев Оптиной пустыни – святых Льва, Макария, Илариона, Анатолия, Варсонофия, Иосифа и Анатолия (мл.). 23 октября 1998 года их мощи перенесены во Владимирский храм и положены в гранитные раки для поклонения верующих. Таким образом, храм стал новым местом упокоения оптинских подвижников и обрел особый духовный статус. Во Владимирской церкви ежедневно совершаются исповедь, водосвятные молебны и акафисты преподобным старцам Оптинским.