В начале XVII века на месте нынешнего храма находилась деревянная церковь во имя великомученика Никиты. Название «Никитники» связано как с именем святого, так и с фамилией богатого ярославского купца Григория Леонтьевича Никитникова, поселившегося в этом районе. В 1628 году Никитников был пожалован в московские купцы и вскоре стал одним из наиболее влиятельных торговцев своего времени. Благодаря его инициативе и финансированию в 1631–1634 годах была возведена новая каменная церковь, посвящённая Живоначальной Троице. Строительство храма стало выражением благодарности купца за успешную торговую деятельность и благополучие его семьи.
Архитектурный облик храма представляет собой бесстолпный четверик, увенчанный пятью главами, из которых центральная является световой. К основному объёму примыкают два придела с северной и южной сторон, также увенчанные главами. С западной стороны расположены паперть и галерея, к которым примыкает шатровая колокольня. Южное крыльцо, оформленное шатром, выходит непосредственно на проезжую часть переулка. Фасады храма богато украшены белокаменной резьбой и поливными изразцами, что придаёт зданию особую нарядность и подчёркивает его принадлежность к стилю «московское узорочье».
Внутреннее убранство храма отличается высокохудожественными росписями, выполненными в 1652–1653 годах мастерами Оружейной палаты, среди которых, предположительно, были Иосиф Владимиров и Симон Ушаков. Росписи охватывают стены, своды и столпы, изображая сцены из Священного Писания и житий святых. Иконостас храма также выполнен выдающимися иконописцами того времени и включает иконы, признанные шедеврами русского искусства.
В XVIII–XIX веках храм продолжал функционировать, однако значительных изменений в его архитектуре и убранстве не происходило. После революции 1917 года храм был закрыт, но, в отличие от многих других московских церквей, избежал разрушения. В 1920-х годах здание было передано Государственному историческому музею, что способствовало сохранению его уникального архитектурного и художественного наследия. В период с 1924 по 1930 годы в храме проводились реставрационные работы, направленные на раскрытие и сохранение первоначальных росписей и декоративных элементов.
