В 1654 году в Троицкой Слободе была построена первая деревянная церковь во имя Святой Живоначальной Троицы. Точная причина её возведения в архивных документах не указана, однако известно, что в том году в Переславле свирепствовала эпидемия моровой язвы, унёсшая значительную часть населения. Возможно, строительство церкви было связано с этими событиями.
В 1763 году первоначальная деревянная церковь сгорела. На её месте, благодаря усилиям прихожан, была возведена новая деревянная церковь, освящённая в честь Святой Живоначальной Троицы. Освящение было проведено по благословению епископа Переславского Сильвестра (Строгальского).
В 1855 году на средства прихожан была построена каменная церковь, заменившая деревянную. Новый храм имел два престола: главный — во имя Живоначальной Троицы и тёплый придел в честь преподобного Никиты Столпника. Архитектурно здание выполнено в русско-византийском стиле, характерном для середины XIX века.
25 февраля 1907 года возле алтарной стены храма был погребён подвижник, с детства принявший на себя подвиг юродства Христа ради, блаженный Михаил Переславский, известный как Миша-Самуил. В 1913 году, во время празднования 300-летия дома Романовых, император Николай II посетил Переславль-Залесский. На обратном пути он остановился около храма и передал церкви икону Нерукотворного Спаса. По просьбе монарха на могиле блаженного Михаила была отслужена панихида.
В советский период храм был закрыт, а его здание использовалось для различных хозяйственных нужд, включая размещение мукомольного завода, авторемонтных мастерских и производства сетки-рабицы. Для проезда техники в южной стене Никитского придела был сделан широкий пролом.
В 1999 году церковь Живоначальной Троицы была передана Никитскому монастырю, после чего начались работы по её восстановлению. Первая литургия после длительного перерыва состоялась в День Святой Троицы 30 мая 1999 года.
