Первое упоминание о храме во имя Святой Живоначальной Троицы в Старой Руссе относится к 1497 году, где он фигурирует как «Троицкая улитцкая церковь» в писцовых книгах. Деревянный храм был сожжён в 1609 году в период Смутного времени литовскими войсками. В описи 1625 года место обозначено как пустующее. В 1680 году на средства старорусского купца Якова Тверева начато строительство каменного пятиглавого храма, завершённое к 1684 году. Освящение состоялось 13 декабря 1684 года митрополитом Новгородским и Великолуцким Корнилием.
В 1759 году пожар повредил храм и уничтожил соседнюю деревянную церковь Иоанна Златоуста. Восстановление завершилось к 1767 году, при этом в притворе Троицкой церкви был устроен придел во имя Иоанна Златоуста. В 1836 году ураган сорвал купол, повредил стены и главы, что потребовало срочного демонтажа четырёх боковых глав. Капитальный ремонт начался в 1854 году по распоряжению императора Николая I под руководством архитектора К.А. Тона. Работы включали укрепление сводов, надстройку барабанов, изменение формы кровли и перенос придела. Освящение обновлённого храма состоялось в 1860 году.
В 1930-х годах храм использовался как зернохранилище, а в 1938 году был закрыт. Во время Великой Отечественной войны здание значительно пострадало: утрачены кровля, главы, часть кладки. Реставрация проводилась в 1968–1975 годах под руководством Т.В. Гладенко. В 1980 году храм передан краеведческому музею. В 1996 году здание возвращено Русской Православной Церкви, а в 1997 году совершено его освящение.
Архитектура храма характерна для посадских церквей XVII века. Здание кубической формы, четырёхстолпное, трёхапсидное, с пятиглавым завершением. Фасады украшены пилястрами, килевидными кокошниками и фигурным кирпичным карнизом. Оконные проёмы оформлены наличниками с колонками. Исторические интерьеры и утварь, включая напрестольный крест 1682 года и потир 1645 года, утрачены.
