В 1670 году, во время восстания под предводительством Степана Разина, Алатырь подвергся нападению. Отряд атамана Осипова захватил город и сжёг деревянный собор, в котором укрывались воевода Акинфей Бутурлин с семьёй и дворянами.
Существующее ныне каменное здание собора было возведено в период с 1737 по 1747 годы. Архитектурный комплекс собора в середине XVIII века включал три храма: соборный каменный храм с престолом в честь Рождества Пресвятой Богородицы, тёплый каменный храм без колокольни, построенный в 1703 году, с престолом в честь Усекновения главы Иоанна Предтечи, и приписной кладбищенский каменный храм с тремя престолами — в честь Воздвижения Честного Животворящего Креста Господня, Всех Святых и иконы Божией Матери «Неопалимая Купина».
В 1774 году, во время восстания Емельяна Пугачёва, Алатырь вновь оказался в центре событий. 24 июля Пугачёв вошёл в город, где был встречен местными жителями с хлебом и солью. В соборе Рождества Пресвятой Богородицы в его честь был отслужен молебен. Здесь же Пугачёв зачитывал свои манифесты и проводил казни дворян, отказавшихся присягнуть ему на верность.
В описи имущества церкви 1823 года указано, что на колокольне собора находилось пять колоколов, а также большие часы. В 1850 году, после серьёзного ремонта, вновь устроенный престол собора был освящён епископом Симбирским и Сызранским.
В советский период, в 1936 году, собор был закрыт, колокольня разрушена, а здание использовалось в различных хозяйственных целях. Во время Великой Отечественной войны здесь сушили картофель для фронта, а позже производили бочки. В 1974 году собору был присвоен статус памятника архитектуры XVIII века и обеспечена государственная охрана.
Богослужения в соборе возобновились в 1994 году после освящения. В ходе восстановительных работ в 1997 году был найден закладной камень с надписью: «Сей божественный храм начал созидаться собранным от боголюбивых подателей иждивением в лето от Рождества Христова 1770 6 июня».
