Строительство храма было инициировано в 1883 году после серии разрушительных пожаров 1879 года, охвативших Оренбург и уничтоживших значительную часть деревянных построек, включая Георгиевскую церковь в казачьем предместье Форштадт. Инициатива возведения нового храма принадлежала казакам Оренбургской станицы, при активном участии попечителя и подрядчика Е.Г. Колокольцева. Проект храма был разработан инженер-капитаном В.П. Сахаровым. Закладка храма состоялась весной 1883 года, а освящение — 4 мая 1886 года епископом Оренбургским и Уральским Вениамином II (Смирновым).
Первоначально храм был однопрестольным, освящённым во имя святителя и Чудотворца Николая. В 1910 году к основному объёму были пристроены два боковых придела: правый — во имя святого великомученика и целителя Пантелеимона, и левый — в честь Успения Божией Матери. Таким образом, храм стал трёхпрестольным. Архитектурно здание выполнено в стиле классицизма, с композиционной схемой плана «корабль», включающей входной притвор, трапезную, основной объём и три гранёные апсиды.
7 августа 1891 года храм посетил цесаревич Николай Александрович, будущий император Николай II, возвращаясь из восточного путешествия. В память об этом событии была возведена часовня, в которую казаки на свои средства приобрели икону в честь чудесного избавления цесаревича от опасности в Японии.
В 1936 году храм был закрыт, и его здание использовалось для различных нужд: сначала как общежитие, затем, после 1942 года, для размещения эвакуированных из Москвы и Ленинграда архивов НКВД. 12 апреля 1944 года храм был вновь открыт для богослужений. В 1955–1958 годах храм был заново расписан местным художником Владимиром Рублёвым. 15 марта 1959 года был освящён новый иконостас, выполненный в стиле позднего ампира по проекту епископа Михаила (Воскресенского).
В 1968 году был освящён четвёртый придел в честь Всех святых. В период с 1988 по 1990 годы, в связи с 1000-летием Крещения Руси, по проекту архитектора Н.А. Быковской из Московского института «Спецпроектреставрация» была проведена реконструкция храма: сооружён новый купол вместо старого деревянного, расширен придел Всех святых, надстроена новая высокая колокольня, построена водосвятная часовня, произведена роспись нового купола и золочение всех трёх иконостасов.
В 1994 году на восточной стороне храмовой территории была возведена водосвятная часовня. В 1997–1998 годах построено церковное административное здание, где разместились трапезная, епархиальная типография, воскресная школа, бухгалтерия, библиотека и гостиница для священнослужителей. В 2007 году введён в действие новый храм-крестильня. С 1991 года при храме работает воскресная школа для детей.
