Инициатором создания монастыря выступила Татьяна Кононова (в монашестве — игуменья Таисия), уроженка Оренбурга, стремившаяся к иноческой жизни.Собрав вокруг себя единомышленниц, она основала женскую общину, целью которой было создание монастыря.
В 1859 году, благодаря ходатайству купца Николая Деева, городское управление Оренбурга выделило общине 10 десятин земли для строительства обители. В 1866 году Успенская женская община была официально открыта, а в 1872 году преобразована в Свято-Успенский женский монастырь.
Строительство двухэтажного храма Успения Пресвятой Богородицы началось в 1868 году по проекту архитектора Константина Тона, известного своими работами, включая храм Христа Спасителя в Москве. В росписи храма принимал участие художник Лукиан Попов. 13 сентября 1875 года строительство было завершено, и на следующий день храм освящен митрополитом Оренбургским и Уральским Митрофаном.
В 1888 году была завершена постройка каменной колокольни, на втором этаже которой устроен храм Иверской иконы Божией Матери в благодарность за избавление обители от пожара 1879 года. К началу XX века монастырь включал в себя двухэтажный корпус для проживания сестер, больницу, трапезную, игуменский корпус, мастерские и приют для девочек-сирот.
В 1923 году монастырь был упразднен, а в 1928 году храм и колокольня разрушены. Здания монастыря использовались для различных нужд, включая размещение детских домов и учебных заведений.
В 2000 году началось возвращение монастырских помещений Русской Православной Церкви. В 2010 году территория обители была передана Оренбургской епархии, и началось восстановление монастыря. В здании бывшей трапезной на верхнем этаже создан храм Успения Пресвятой Богородицы. С 2011 года в монастыре ежедневно совершаются богослужения, продолжается восстановление разрушенных корпусов и благоустройство территории.