Храм в честь иконы Божией Матери «Живоносный Источник» расположен на территории Задонского Рождество-Богородицкого мужского монастыря. Первое упоминание о святом источнике относится к XVIII веку, когда здесь была построена деревянная часовня. Водный источник почитался среди паломников, посещавших монастырь, особенно после того, как в 1769 году в обитель прибыл святитель Тихон Задонский, проводивший время в молитвах у этого места.
В XIX веке над источником возвели каменную часовню, которая была разрушена в революционный период. Водный источник был замурован, но в 1994 году началось восстановление святыни. В 2006 году оборудовали купальню и место для переодевания. Архитектурное решение современной часовни-купальни выполнено в традициях православного зодчества, с отдельными входами для мирян и монашествующих.
Исторически икона Божией Матери «Живоносный Источник» связана с константинопольским преданием V века о чудесном исцелении воина Льва Маркелла, впоследствии ставшего императором. В Задонске почитание этой иконы установилось в связи с монастырским источником, который, по преданию, посещал святитель Тихон. В дореволюционный период здесь совершались крестные ходы, особенно в день празднования иконы — в пятницу Светлой седмицы.
После закрытия монастыря в 1919 году часовня пришла в упадок. Возрождение началось в 1990-х годах, когда монастырь был возвращен Русской Православной Церкви. Сегодня храм-часовня является частью монастырского комплекса и местом паломничества. Богослужения совершаются в дни празднования иконы и во время водоосвятительных молебнов.