Храм Рождества Пресвятой Богородицы входит в состав ансамбля Задонского Рождество-Богородицкого мужского монастыря. Первое упоминание о монастыре относится к 1610–1615 годам, когда два схимонаха Кирилл и Герасим, выходцы из московского Сретенского монастыря, основали обитель на берегу реки Тешевки при её впадении в Дон. Первоначально монастырь именовался Тешевским, а позднее — Задонским, по расположению за Доном относительно Москвы.
В 1692 году пожар уничтожил деревянные постройки монастыря, включая храмы и архив. Чудом сохранилась Владимирская икона Божией Матери, принесённая основателями. К 1697 году обитель была восстановлена. В 1736 году начато строительство первого каменного храма с двумя приделами — в честь Рождества Иоанна Предтечи и во имя святителя Евсевия Самосатского. Главный престол освятили в 1741 году.
В 1769 году в монастырь прибыл святитель Тихон Задонский, который провёл здесь последние годы жизни и был погребён в 1783 году. В 1846 году при разборке старого Владимирского собора его мощи были обретены нетленными, а в 1861 году состоялось официальное прославление святителя. В связи с этим храм Рождества Пресвятой Богородицы, построенный в 1862 году, стал местом временного пребывания мощей в зимний период (с 5 октября по 1 мая).
В советский период, начиная с 1919 года, монастырь был закрыт, а храм Рождества Пресвятой Богородицы использовался как производственное помещение овощного завода. В 1990-е годы началось восстановление обители, включая реставрацию храма с возобновлением первоначального пятиглавия. Архитектурный декор здания выполнен в стиле эклектики с элементами псевдорусского стиля.
Храм соединён тёплой галереей с больничным корпусом, построенным в 1864 году, где располагались библиотека, ризница, училище для сирот и служебные помещения. Западный фасад здания украшен филенчатыми пилястрами, оконные проёмы имеют полуциркульное и лучковое завершение. Центральная часть фасада оформлена тамбуром с килевидными архивольтами.
