Храм Николая Чудотворца в Задонске был сооружен в 1824–1837 годах по проекту воронежского губернского архитектора И. А. Блицына. Первоначально он являлся надвратным храмом в составе колокольни Задонского Рождество-Богородицкого мужского монастыря. Архитектурный стиль сооружения относится к классицизму. Храм располагался на первом этаже колокольни, которая также включала гостиничный корпус для паломников.
В 1835 году колокольня была освящена архиепископом Антонием. Под колокольней находились главные ворота монастыря, использовавшиеся в особых торжественных случаях. Вход украшал греческий портик с колоннами, а потолок арки был расписан изображением ангелов, несущих икону Николая Чудотворца. Храм во имя святителя Николая Мирликийского на втором этаже колокольни был освящен в 1838 году.
В начале XX века храм продолжал функционировать в составе монастырского комплекса. В период революционных событий и антирелигиозных кампаний 1920–1930-х годов монастырь был закрыт, а его имущество конфисковано. В 1929 году часть монашествующих, включая служивших в Никольском храме, была арестована. В 1930 году храм окончательно закрыли для богослужений.
В послевоенный период здание бывшего храма использовалось для светских нужд. В 1960-х годах здесь располагался маслозавод, а с 1968 года — Дом пионеров. В ходе реконструкции здания в 1967 году элементы храмовой архитектуры были значительно изменены или утрачены.
В 1990 году Задонский Рождество-Богородицкий монастырь был возвращен Русской Православной Церкви, и началось восстановление его храмов. Однако точная дата возобновления богослужений в Никольском храме в колокольне в доступных источниках не указана.
