Пятиглавый Успенский собор — крупнейший храм Лавры (1559-1585), заложенный Иваном IV как «всероссийская кафедра Богородицы» по образцу кремлёвского Успенского собора. Размеры (29,2 × 42,3 м) и высота 43 м превзошли московский прототип, а толстые (2,25 м) кирпичные стены позволили создать огромный, залитый светом объём. Освящён в 1585 году митрополитом Дионисием при царе Фёдоре Иоанновиче. Декор фасадов лаконичен: аркатурно-колончатый пояс и мощные лопатки-контрфорсы. Внутри — одно из крупнейших русских пятиъярусных иконостасов, расписанный артелью Дмитрия Григорьева (1684), и фрагменты фресок круга Симона Ушакова.
Храм играл военно-стратегическую роль: во время осады 1608-1610 гг. на крышу вывели пищали, а под криптой — артиллерийский погреб. В 1730-х пристроены каменные крыльца в стиле Анны Иоанновны; в 1766 г. собор получил ныне привычные барочные луковичные главы. После закрытия 1920-х он служил складом тканей Госфонда, что привело к пожару 1941 г.; восстановление завершено к 1959 г., повторно освящён 21 апреля 1946 г.
Собор хранит: деревянный гроб Сергия Радонежского (до 1585 г. мощи покоились здесь), раки Иннокентия Московского и святых Радонежских; осветительный медный позолоченный хорос весом 1300 кг (мастера Климовых, 1860). На хорах действует музей «Ризница» с витринами византийского шитья XIII–XIV в.
С 2018 г. храм оборудован системой климат-мониторинга: 48 беспроводных датчиков передают данные о влажности в центр Лавры — уникальный для России пилотный проект сохранения фресок.
