Духовская церковь — второй каменный храм Лавры (1476-1477) и старейший в Руси образец типа «иже под колоколы»: звонница интегрирована в цилиндрический барабан, опирающийся на своды основного четверика. Построенная псковскими мастерами по указу великого князя Ивана III, она стала экспериментальной площадкой московского кирпичного строительства. Пояс из терракотовых балясин с поливными изразцами (в центре кокошников — зелёные медальоны с розетками) считается предтечей узорочья конца XVI в. В XVII в. храм расписывался артелью Степана Рязанца, сохранились клейма «Деисус» и «Чудо в Кане». На звоннице до 1918 г. висел «всполошной» колокол — сигнал тревоги для всей Радонежской земли.
После закрытия монастыря (1920) церковь превратили в радиолабораторию Воениздата; кирпичную кладку пронизали кабель-каналы, башенка была обшита жестью под антенны. Реставрация 1963-1974 гг. под руководством Барановского вернула древний фриз и изразцы; в 2002-2006 гг. восстановили колокольный ярус (установлено 8 колоколов, главный — 2,3 т). Сегодня храм служит братским зимним храмом: богослужения совершаются ежедневно в 6:00 и 18:00; летом открыт подъём на звонницу для групп до 15 человек.
Археологи раскопали в подклете остатки деревянной церкви 1412 г., заложенной игуменом Никоном после набега Едигея. Научная лаборатория Лавры регулярно сканирует стены лазерным лидаром: кирпич XV в. содержит включения известняка, дающие разные отражения; по этим данным оценивают влажность и старение кладки.
Культурное влияние Духовской проявилось и в искусстве: именно её силуэт использовал Андрей Тарковский для композиции Андрей Рублёв в одноимённом фильме; копия барабана стоит в парке «Россия — Моя история» в Сергиевом Посаде.
