На месте нынешнего храма в XVII веке существовала деревянная Тихвинская церковь, служившая духовным центром Спасской слободы Дмитрова. Спасская слобода начиналась от Егорьевских ворот Дмитровского кремля и простиралась до Тихвинской церкви. В связи с ветхостью деревянного строения и ростом населения возникла необходимость возведения нового храма. В период с 1794 по 1801 годы на средства благотворителей Г. И. Лошкина и А. С. Фуфаева была построена новая кирпичная церковь.
Архитектурно Троице-Тихвинская церковь выполнена в стиле барокко с элементами классицизма. Здание представляет собой трёхэтажную конструкцию, объединённую с колокольней. Высокий четверик венчает одна глава. На первом этаже расположена тёплая Никольская церковь, на втором — холодная церковь Святой Троицы, а на третьем этаже (на хорах) находится Тихвинский придел.
В 1930-х годах, в период антирелигиозной политики советского государства, храм был закрыт. В его здании размещалась артель Всесоюзного общества слепых. Рядом с церковью находилось кладбище, на месте которого впоследствии был построен родильный дом, ныне расположенный на территории Дмитровской городской больницы.
В 1996 году здание храма было отремонтировано и вновь открыто для богослужений. В 2009 году состоялось великое освящение восстановленного Троицкого храма и была проведена Божественная литургия.
