Монастырь был основан в 1569 году по указу царя Ивана IV на месте явления иконы Божией Матери «Одигитрия» святому блаженному Тимофею. С момента основания обитель играла важную роль в духовной жизни региона и служила оплотом православия на западных рубежах Русского государства. В период Ливонской войны и Смутного времени монастырь выполнял также оборонительные функции, защищая местное население от внешних угроз.
Архитектурный ансамбль монастыря формировался на протяжении нескольких столетий. Центральным сооружением является Успенский собор, построенный в 1569 году псковскими мастерами в традициях псковской архитектурной школы. Собор представляет собой одноэтажное каменное здание с толстыми стенами и узкими окнами-бойницами. В 1770 году к собору был пристроен южный придел во имя иконы Божией Матери Одигитрии на средства князя Львова, а в 1776 году — северный придел во имя Покрова Пресвятой Богородицы, построенный на средства помещика Карамышева. Под северным приделом была устроена фамильная усыпальница Карамышевых. В конце XVIII века первоначальное восьмискатное покрытие собора было заменено на четырёхскатное.
В XVIII веке, после указа Екатерины II 1764 года о секуляризации церковных земель, монастырь был отнесён к третьеразрядным, а его земли и угодья отошли в казну. Несмотря на это. В XIX веке монастырь стал местом погребения членов семьи Пушкиных-Ганнибалов, включая самого поэта Александра Сергеевича Пушкина, похороненного здесь в 1837 году.
В 1924 году монастырь был закрыт, а его здания использовались для различных хозяйственных нужд. Во время Великой Отечественной войны обитель серьёзно пострадала: некоторые здания были разрушены, другие заминированы. После войны, в 1949 году, большая часть монастырских строений была восстановлена и до 1992 года использовалась как экспозиционная и административная часть Государственного мемориального музея-заповедника А. С. Пушкина.
В 1992 году монастырь был возвращён Русской Православной Церкви. 29 мая того же года при участии Патриарха Московского и всея Руси Алексия II в Успенском соборе были торжественно возобновлены богослужения. С тех пор монастырь функционирует как действующий мужской монастырь, в котором регулярно проводятся богослужения и осуществляется духовное окормление верующих.
