Монастырь был основан в 1584 году на месте подвига преподобного Никандра, в миру Никона (1507–1581), который провёл в молитве почти полвека в уединении. Спустя два с половиной года после его кончины, в его хижине поселился мирянин, впоследствии принявший монашеский постриг с именем Исаия. По просьбе братии, Исаия отправился к архиепископу Новгородскому Александру с просьбой о рукоположении в иеромонахи и благословении на строительство церкви. Архиепископ Александр рукоположил Исаию в иеромонаха и назначил игуменом новой обители, благословив строительство церкви в честь Благовещения Пресвятой Богородицы при гробе преподобного Никандра. Таким образом, было положено начало монастырю.
В декабре 1598 года царь Феодор Иоаннович издал «обельную» грамоту, освобождавшую монастырь от земельных податей и закреплявшую за ним пустоши, пашни и рыбные ловли в Порховском уезде в Михайловском погосте. Жизнь первых насельников была трудна, они вынуждены были неустанно трудиться, терпя пустынные лишения. В XVII веке обитель часто оставалась без священнослужителя «скудости ради пустынного места», и братия исполняла молитвенные правила келейно.
Монастырь неоднократно подвергался внешним опасностям. В 1665 году польские отряды разорили и разграбили обитель, монахов убили, а игумена взяли в плен на год. В 1673 году в результате пожара сгорели три деревянные церкви: во имя Святой Троицы, преподобного Никандра и преподобного Александра Свирского, а также монастырская казна, иконы, книги и ризы. После этих событий игумен обратился за помощью к царю Алексею Михайловичу, который пожаловал обители значительные земельные угодья, что укрепило её материальное положение. На пожертвования были построены каменные церкви, колокольня и новые деревянные кельи. Монастырь значительно расширился, а мощи преподобного Никандра были положены в южную стену соборной Благовещенской церкви.
В 1687 году по просьбе игумена Евфимия и братии, патриарх Иоаким благословил освидетельствование мощей преподобного Никандра, которые были обретены нетленными. Было постановлено праздновать память преподобного Никандра в день храмового праздника Благовещения Пресвятой Богородицы и в день его преставления 24 сентября. В дальнейшем в обители стали отмечать и день обретения его мощей.
В 1764 году, при составлении духовных штатов, монастырь был переведён в разряд безокладных заштатных пустыней и лишился 390 душ крестьян и многочисленных земельных владений. Однако при размежевании Псковской губернии в 1781 году обители удалось вернуть почти все земли и угодья, пожалованные царём Алексеем Михайловичем.
В начале XIX века, благодаря милости императора Павла I и усилиям архимандрита Геннадия, монастырь получил поддержку. Император, проникшись любовью к Никандровой пустыни, принял деятельное участие в её судьбе. В этот период были начаты масштабные строительные работы, однако после смерти императора и увольнения архимандрита Геннадия они были прерваны.
Своего расцвета Никандрова пустынь достигла во времена архимандрита Игнатия Васильева (1853–1870). В этот период были перестроены многие монастырские здания, построена дорога от обители до Порхова, посажены фруктовые сады. За стенами обители находились гостиницы для паломников, хозяйственные постройки и мастерские. Имелась мельница, большой скотный двор, а недалеко находилось братское кладбище с деревянным храмом во имя Кирилла и Мефодия.
В 1855 году установлен ежегодный крестный ход из пустыни в Порхов с иконой преподобного Никандра.