Основание обители связано с именем преподобного Евфросина Псковского (в миру Елеазара), который в 1425 году, покинув Снетогорский монастырь, поселился на берегу реки Толбы, где основал монашескую общину.В 1447 году на вершине холма была возведена деревянная церковь во имя Трёх Святителей с приделом в честь преподобного Онуфрия Великого.
Преподобный Евфросин составил один из древнейших известных монашеских уставов, регламентирующий быт иноческой жизни. Монастырь стал первой на Псковщине "богорадной" обителью, не требовавшей вклада для поступления. После смерти Евфросина в 1481 году деревянная церковь стала кладбищенской, а монастырь был перенесён на новое место, где была построена каменная Трёхсвятительская церковь.
В начале XVI века в монастыре подвизался старец Филофей, которому приписывается формулирование концепции "Москва — третий Рим". В этот период обитель стала центром духовной жизни Псковской земли, здесь было составлено житие преподобного Евфросина и проведено редактирование Псковской первой летописи. В эти же годы в монастыре был переписан экземпляр "Слова о полку Игореве", впоследствии попавший к Алексею Мусину-Пушкину.
Монастырь неоднократно подвергался нападениям литовцев, поляков и ливонских рыцарей, что приводило к его разорению. В 1766 году, после упразднения Великопустынского Преображенского монастыря, его братия была переведена в Спасо-Елеазаровскую обитель, которая получила дополнительное название Великопустынской. В монастырский храм был освящён престол в честь Преображения Господня, и сюда были перенесены святыни Великопустынской обители, включая чудотворную икону "Спас Елеазаровский".
В 1804 году в обитель была переведена братия упразднённого Снетогорского монастыря, а в 1813 году монастырь был возведён во 2-й класс. С 1884 года при монастыре действовала богадельня. До 1906 года обитель именовалась Спасо-Елеазаров-Великопустынский-Трёхсвятительский мужской монастырь 2-го класса; в 1906 году она была преобразована в общежительную пустынь.
В 1918 году монастырь был официально упразднён, окончательно закрыт в ноябре 1923 года. В 2000 году обитель возобновила свою деятельность как женский монастырь.
Архитектурный ансамбль монастыря включает в себя собор Трёх Святителей, построенный во второй половине XVI века, который представляет собой образец псковской средневековой архитектуры. Собор является трёхапсидным храмом с одним куполом, характерным для псковского зодчества того времени.
