Основателем монастыря считается преподобный Ефрем Новоторжский, бывший конюший киевского князя Владимира I Святославича. После гибели своих братьев Георгия и Моисея, Ефрем удалился от светской жизни и основал обитель на берегу реки Тверцы, посвятив её первым русским святым — князьям Борису и Глебу. Первоначально монастырь представлял собой деревянные постройки, включая храм, который в 1038 году был заменён на каменный.
В 1577 году, при правлении Ивана Грозного, к старому Борисо-Глебскому собору были пристроены два придела. В 1607 году, во время польского нашествия, монастырь подвергся значительным разрушениям. В XVII веке была построена Введенская церковь на месте сожжённой деревянной. В 1717 году возведена церковь Входа Господня в Иерусалим. Пожар 1742 года нанёс значительный урон монастырю, после чего началось его восстановление.
В 1785–1796 годах, по проекту архитектора Николая Львова, на месте старого собора был построен новый Борисо-Глебский собор в стиле классицизма. Первый камень в основание собора заложила императрица Екатерина II. В 1804 году была заложена Спасская надвратная церковь-колокольня, строительство которой вёл архитектор Яков Ананьин. В 1839–1840 годах были проведены работы по обновлению собора, включая замену пола, штукатурку стен и колонн, а также установку новых сводов. В 1892 году произведена реставрация собора, включающая обновление штукатурки, лепнины, установку новых окон и дверей.
До 1764 года монастырю принадлежали значительные земельные владения, включая 2232 крестьянина мужского пола. После секуляризации монастырь утратил большую часть своих владений. В XIX — начале XX века монастырь владел садами, огородами и двумя мельницами.
В 1925 году монастырь был закрыт, и на его территории разместилась тюрьма строгого режима. Позднее здания использовались под лечебно-трудовой профилакторий и Всероссийский историко-этнографический музей. В 1993 году монастырь был возвращён Русской Православной Церкви, и началось его восстановление. В 1995 году в монастыре поселились первые пять монахов. 24 июня 1998 года возобновилась литургическая жизнь в монастыре. С 2008 года монастырь включён в программу «Культура России», и продолжаются работы по его восстановлению.
