Новоторжский Борисоглебский мужской монастырь основан около 1038 года преподобным Ефремом Новоторжским, бывшим конюшим киевского князя Владимира Святославича. Основание обители связано с мученической кончиной князей Бориса и Глеба, в честь которых был заложен первый храм. Первое достоверное упоминание о монастыре относится к 1534 году, хотя житийная литература XVII века приписывает его основание XI веку.
В 1577 году к Борисоглебскому собору были пристроены два придела: во имя преподобного Ефрема Новоторжского и святых Иоакима и Анны. В 1607 году монастырь пострадал от польского нашествия: деревянная Введенская церковь была сожжена вместе с частью братии. Каменная Введенская церковь, сохранившаяся доныне, возведена в XVII веке на месте сгоревшей.
В 1785-1796 годах по проекту архитектора Н.А. Львова на месте обветшавшего собора построен новый Борисоглебский собор в стиле классицизма. Закладку первого камня совершила императрица Екатерина II. В 1804-1811 годах возведена надвратная церковь-колокольня Спаса Нерукотворного Образа высотой 55 метров.
В 1925 году монастырь был закрыт. На его территории размещались: тюрьма строгого режима (до 1970-х), лечебно-трудовой профилакторий (до 1980-х) и Всероссийский историко-этнографический музей. В 1993 году часть зданий возвращена Русской Православной Церкви. 24 июня 1998 года в день памяти преподобного Ефрема Новоторжского возобновлена литургическая жизнь.
Мощи основателя монастыря преподобного Ефрема и его ученика преподобного Аркадия Новоторжского почивают под спудом в монастыре. В XIX веке для мощей была изготовлена серебряная рака работы С.Ф. Верховцева. В монастыре сохранились частицы мощей святых князей Бориса и Глеба.