Основание обители связано с явлением чудотворной иконы Рождества Пресвятой Богородицы в конце XVI века.
В 1594 году в селе Игнатьево, близ Александровской слободы, по указу царя Фёдора Иоанновича и с благословения патриарха Иова была построена деревянная церковь в честь Рождества Пресвятой Богородицы. Вскоре после освящения храма его храмовая икона неоднократно исчезала и чудесным образом обнаруживалась в лесном урочище «Псковитино Раменье». После третьего подобного случая патриарх Иов благословил перенести церковь на место явления иконы, что и было осуществлено. Священник Григорий, настоятель храма, поселился при новой церкви и продолжил служение.
В период Смутного времени, в начале XVII века, церковь пришла в запустение. В 1640 году монах Лукиан, уроженец города Галича, прибывший из Спасо-Прилуцкого монастыря, поселился при обветшавшем храме и начал его восстановление. В 1646 году он был рукоположен в сан иеромонаха патриархом Иосифом. 28 августа (10 сентября) 1650 года патриарх Иосиф выдал Лукиану грамоту, утверждающую его в качестве настоятеля новообразованной обители. С этого момента начинается история Лукиановой пустыни как монастыря.
После кончины преподобного Лукиана в 1655 году настоятелем монастыря стал иеромонах Корнилий. При его руководстве обитель получила значительные пожертвования от царя Фёдора Алексеевича и других представителей царского рода. В период с 1680 по 1684 годы была построена каменная трапезная церковь Богоявления с приделом во имя святого Феодора Стратилата. В конце XVII века началось строительство каменных келий: в 1690 году был возведён Казначейский корпус, в 1696 году — Хлебные (Настоятельские) кельи и Больничная палата. В 1712 году был освящён собор Рождества Пресвятой Богородицы. В 1714 году при Больничной палате была сооружена церковь во имя святой великомученицы Екатерины. К 1733 году вокруг монастыря была возведена каменная ограда с семью башнями.
В 1771 году монастырская икона Рождества Пресвятой Богородицы прославилась прекращением эпидемии чумы после крестного хода с этим образом вокруг города Александрова. С того времени крестный ход стал ежегодной традицией.
В начале XIX века были построены новый Братский корпус и монастырская гостиница к югу от обители. В 1894 году интерьер собора Рождества Пресвятой Богородицы был расписан. Монастырь имел собственные конный, кирпичный и изразцовый заводы, а также несколько мельниц. Пустыни принадлежали три деревянные часовни на Московской дороге и под Переславлем. В Москве у Сретенских ворот находилось подворье обители.
В 1922 году монастырь был закрыт, его имущество конфисковано, а здания переданы под различные хозяйственные нужды. В 1991 году Лукианова пустынь стала первой возрождённой обителью во Владимирской епархии. В 1992 году были обретены мощи преподобного Лукиана, которые ныне находятся в храме Богоявления в резной деревянной раке. Мощи преподобного Корнилия были обретены в 1995 году и помещены в Троицком храме Успенского женского монастыря города Александрова.
