На месте нынешнего храма ранее находилась деревянная церковь святого великомученика Георгия, которая дала название одной из главных улиц старого города — Егорьевской. С течением времени деревянная постройка обветшала и пострадала от пожара, что обусловило необходимость возведения нового храма. Инициатива строительства принадлежала представителям известной купеческой семьи Кишкиных — Николаю, Василию и их сестре Акилине. Братья Кишкины были крупными парусинными фабрикантами и одними из богатейших жителей Серпухова. Их вклад в строительство нового храма был значителен.
Строительство каменного храма началось в 1746 году и завершилось в 1755 году. Архитектура храма отличается архаичными для XVIII века чертами, что, вероятно, отражает желание заказчиков сохранить традиционные формы зодчества. Храм представляет собой массивный двухстолпный четверик, перекрытый системой коробовых сводов с пятью миниатюрными гранёными барабанами. Фасады храма расчленены лопатками на два прясла и завершены широким фризом с декоративными элементами. Особенностью храма является отсутствие трапезной и наличие с четырёх сторон сводчатых арочных галерей — папертей, скрывавших низкий трёхчастный алтарь. С западной стороны церковь соединялась каменным переходом на арках с оригинальной четырёхъярусной колокольней, представлявшей собой квадрат со скошенными углами. Колокольня увенчивалась куполом с барабанчиком, завершённым шатром с главкой и крестом, и своим обликом почти полностью повторяла Евфимиевскую часозвонную башню Новгородского Кремля.
Внутреннее убранство храма было богато украшено. Семья Кишкиных сделала щедрые вклады церковной утварью. Дочь Василия Кишкина Пелагея и его жена Акилина пожертвовали церковное облачение — ризы из золотой и серебряной парчи с вышитыми изображениями святых. Сам Василий Кишкин вложил в церковную ризницу серебряный ковш с соответствующей надписью.
В начале XIX века рядом с Крестовоздвиженским храмом был возведён храм в честь Печерской иконы Божией Матери. К 1917 году приход Крестовоздвиженского храма насчитывал 24 семьи, проживающих вблизи церкви, среди которых были и иноверцы лютеранского вероисповедания.
В советский период, как и многие религиозные сооружения, Крестовоздвиженский храм подвергся закрытию. Здание было передано текстильной фабрике и подверглось значительной перестройке. Долгое время закрытый храм использовался как складское помещение комбината "Серпуховский текстиль", постепенно ветшая и разрушаясь. Сводчатые перекрытия апсиды рухнули уже в постсоветский период.
Возрождение храма началось с возобновления прихода в 1999 году. 6 октября 2003 года вновь организованный приход Крестовоздвиженского храма под омофором Московской епархии прошёл государственную регистрацию. После банкротства "Серпуховского текстиля", не позднее января 2016 года, местный предприниматель выкупил здание храма и передал в собственность Серпуховскому благочинию Московской епархии. Восстановление храма началось с подготовки проектно-сметной документации и очистки захламлённого и обезображенного здания.
