В период с 1654 по 1660 годы на месте двух деревянных церквей — Преображенской и Петропавловской — был возведён первый каменный храм во имя Преображения Господня. Этот четырёхстолпный пятиглавый храм стоял на высоком подклете и был окружён папертью-галереей с приделами и шатровой колокольней на северо-западном углу. В 1779 году храм получил статус городского собора.
В конце XVIII века было принято решение о строительстве новой ярусной колокольни взамен старой шатровой. В период с 1796 по 1804 годы по проекту архитектора Степана Андреевича Воротилова была возведена пятиярусная колокольня высотой около 116 метров, ставшая второй по высоте в России после колокольни Петропавловского собора. Декоративное убранство колокольни выполнено в традициях раннего классицизма с элементами барокко.
К началу XIX века, в связи с ростом населения Рыбинска, возникла необходимость в более вместительном соборе. После длительных обсуждений, в 1838 году было принято решение о разборке старого храма и строительстве нового на его месте. Проект нового собора был разработан ректором Петербургской Академии художеств Авраамом Мельниковым и доработан архитекторами Иосифом и Людовиком Шарлеманями, а также Петром Висконти. Строительство финансировалось рыбинскими купцами, включая М.Н. Вязьмина, А.И. Миклютина, Л.П. Кувшинникова и А.Д. Смирнова. К 1845 году основные строительные работы были завершены, а к 1851 году завершено оформление интерьеров. Торжественное освящение нового собора состоялось 29 июня 1851 года.
В 1891 году при соборе было основано попечительство о бедных, а в 1892 году — церковно-приходская школа. В 1909 году решением Святейшего синода рыбинский Спасо-Преображенский собор получил статус кафедрального.
В 1929 году собор был закрыт, а в 1930-х годах разрушены барабаны глав. В 1971 году главы были восстановлены по проекту архитекторов А.К. и Т.Я. Россовских. С 1972 года в здании собора размещался филиал областного архива.
В 1996 году колокольня была передана в пользование Русской Православной Церкви, а в 1999 году — весь храм. В результате комплексной реставрации, проведённой в 2003—2007 годах на средства предпринимателя В.И. Тырышкина, Спасо-Преображенский собор был вновь открыт для верующих. 12 июня 2007 года архиепископ Ярославский и Ростовский Кирилл в сослужении других архипастырей совершил чин освящения собора и престолов. Престолы имеют следующее посвящение: главный — в честь Преображения Господня, правый — в честь святого праведного воина Феодора Ушакова, левый — в честь иконы Божией Матери «Знамение».
