История храма восходит к XVIII веку, когда в Самаре существовала деревянная Вознесенская церковь, располагавшаяся на перекрёстке современных улиц Водников и Комсомольской. В апреле 1765 года эта церковь сгорела, но была восстановлена. Спустя 40 лет она вновь пострадала от пожара. В начале XIX века, согласно городскому плану 1804 года, для строительства нового каменного храма было определено новое место в центре города, при условии возведения каменного здания.
В 1838 году в Симбирске был составлен проект каменного Вознесенского храма, который впоследствии был доработан в Санкт-Петербурге для придания ему более правильного и благовидного вида. Строительство храма началось в 1841 году и продолжалось около восьми лет. В 1847 году был освящён правый придел во имя Архистратига Михаила, а в 1848 году — главный престол в честь Вознесения Господня. Левый придел был освящён во имя великомученика Пантелеимона и преподобного Павла Комельского.
Архитектурно храм выполнен в стиле классицизма, представляя собой однокупольную базилику с колокольней, увенчанной тонким шпилем. Внутреннее убранство отличалось богатством: иконостасы, иконы в золочёных ризах с натуральными камнями, серебряные престол и наамвонные подсвечники. Роспись храма была выполнена художником А.П. Кочаевым. Изначально отопление было печным, позднее заменено на калориферное.
С образованием в 1851 году Самарской губернии и открытием епархиального управления Вознесенский храм получил статус кафедрального собора. 31 марта 1851 года в нём был зачитан указ Святейшего Синода об образовании Самарской епархии и совершён благодарственный молебен. Первым кафедральным протоиереем стал Иван Егорович Халколиванов, прослуживший в храме более 30 лет.
В 1894 году кафедра была перенесена в новый Воскресенский собор, однако за Вознесенским храмом сохранилось название собора. В его стенах были освящены Самарское знамя, под которым сражались русские ополченцы в русско-турецкой войне 1877–1878 годов, и принимались высокопоставленные гости, включая императоров Александра II, Александра III и Николая II.
В советский период, 21 января 1930 года, собор был закрыт и использовался под выставку восковых фигур клуба кустарей, а позднее передан под склад. Главный купол и колокольня были разрушены. Восстановление храма началось в начале 1990-х годов. 12 апреля 1993 года здание было передано Самарской епархии, и уже 15 августа того же года возобновились богослужения. Восстановление исторического облика храма проходило по проектам архитекторов В.А. Самогорова и В.Л. Пастушенко. 1 октября 1997 года на храм был водружён главный купол, а в 1999 году заново выстроена 56-метровая колокольня.