Строительство церкви было завершено в 1566 году по указу царя Ивана IV Васильевича (Ивана Грозного) на месте погребения блаженного Исидора Твердислова, известного ростовского юродивого.Строительство осуществлялось под руководством зодчего Андрея Малого.
Архитектурно храм представляет собой типичный образец посадских московских церквей XVI века. Он характеризуется крестово-купольной системой без внутренних столбов, что обеспечивает просторное внутреннее пространство. Фасады здания разделены лопатками на три части, каждая из которых завершается килевидной аркой, придающей сооружению устремлённость вверх. С запада к храму примыкает притвор, предположительно пристроенный в XVII веке.
Внутренние росписи храма были выполнены в 1760—1770-х годах, предположительно ярославскими мастерами братьями Иконниковыми. Они выполнены в стиле барокко с традиционными сюжетами, связанными с жизнью Христа и блаженного Исидора. В 1786 году росписи были обновлены, а иконостас демонтирован.
В XIX веке храм подвергся значительным изменениям: в 1817 году была сооружена серебряная гробница для хранения мощей святых, а вместо старой колокольни была построена новая в стиле классицизма. В 1836 году рядом с храмом было возведено двухэтажное каменное здание для проживания служителей церкви, а в 1845 году были построены каменные ворота на входе во внешний двор церкви.
В советский период храм был закрыт и использовался под складские помещения, что привело к его запустению. В 1930 году церковь была передана в управление музея «Ростовский кремль». В 1955 году под руководством архитектора Л. А. Давида начались реставрационные работы, направленные на восстановление первоначального облика храма.
В 2000 году храм был возвращён Русской Православной Церкви, после чего в нём возобновились богослужения. Были проведены работы по восстановлению пола, установке дренажной системы вокруг храма и реставрации оконных решёток. В 2008 году церковь получила новые колокола. Реставрационные работы продолжаются, в частности, требуется восстановление сохранившихся фресок.
