Храм Вознесения Господня в Осташкове, также известный как Знаменский собор, первоначально являлся главным храмом Знаменского женского монастыря, основанного в 1673 году. Основание монастыря связано с деятельностью трех благочестивых стариц — Екатерины, Марины и Параскевы, получивших благословение Патриарха Московского Питирима и разрешение царя Алексея Михайловича. Первый деревянный храм в честь иконы Божией Матери «Знамение» с приделом пророка Илии был возведен на месте, называемом Старое Струговище.
В 1692 году при игуменье Пелагее построен теплый придел в память Усекновения главы Иоанна Предтечи. Каменный собор возведен в 1730-1748 годах при игуменье Евфимии (Евстолии) с сохранением прежних престолов. В 1764 году монастырь получил статус штатного, что обеспечивало регулярное государственное финансирование. В 1783-1793 годах ансамбль дополнила надвратная Тихвинская церковь.
После пожара 1868 года, уничтожившего значительную часть монастыря, собор перестроен по проекту техника Демидова в псевдорусском стиле. В 1844 году при монастыре открыт приют для бедных девиц духовного звания. Монастырь упразднен в 1928 году, а собор закрыт. В 1947 году, по ходатайству верующих, возобновлены богослужения в зимнем приделе, куда перенесены мощи преподобного Нила Столобенского из разоренной Ниловой пустыни. До 1995 года мощи находились в соборе, после чего возвращены в возрожденную обитель, а в храме оставлены их частицы.
Архитектурный облик собора сочетает элементы барокко и эклектики. Пятипрестольный храм включает приделы: Усекновения главы Иоанна Предтечи, Знаменский, Спасский и Всех Святых. Здание признано объектом культурного наследия регионального значения. В советский период помещения использовались под зерносклад и музейную экспозицию. Реставрационные работы проводились во второй половине XX века и в 2000-х годах.