В XVI веке на месте нынешнего храма находилась деревянная церковь во имя святых мучеников Флора и Лавра, служившая центром Коломенской Ямской слободы. После переноса слободы на Зацепу в конце XVI века и строительства там новой церкви, прежний храм продолжал существовать. В московских летописях 1642 года упоминается церковь «Успения Пресвятой Богородицы да мучеников Флора и Лавра, что в старой Коломенской Ямской слободе». К 1657 году она известна как «Церковь Пречистой Богородицы Успения, что в Казачьей слободе за Москвою-рекою», однако в этот период храм не функционировал. В 1662 году церковь была восстановлена и освящена как Успенский храм в Казачьей слободе.
В 1695—1697 годах на средства стольника Василия Фёдоровича Полтева был построен каменный одноглавый храм в стиле московского барокко, сохранившийся до наших дней. В 1723 году церковь подверглась обновлению. В 1768 году, благодаря стараниям Г. Нестерова, был добавлен придел в честь Седмиезерной иконы Божией Матери. В 1797—1798 годах, на средства вдовы генерал-майора П. И. Поздняковой, храм приобрёл современный вид: были построены трапезная с двумя приделами — Седмиезерским и иконы Божией Матери «Утоли Моя Печали», а также новая колокольня в стиле классицизма.
Во время пожара 1812 года внутреннее убранство храма было уничтожено, но к 1818 году, усилиями церковного старосты Никиты Игнатьевича Карпышева, храм был восстановлен. В 1869—1872 годах, на средства прихожан и церковного старосты Д. П. Рогаткина, была проведена отделка храма, в ходе которой облик трапезной и колокольни претерпел некоторые изменения.
В 1922 году, после закрытия храма, его помещения были использованы под архив и типографию. В этот период были изъяты церковные ценности, снесены глава храма, верх колокольни и разрушен дом причта. В 1970—1980 годах была проведена реставрация здания. В конце 1990 года храм был возвращён Русской Православной Церкви, и в 1994 году в нём возобновились богослужения.
Архитектурно храм представляет собой одноглавый восьмерик на четверике, характерный для московского барокко конца XVII века. Фасады украшены полуколоннами, профилированными карнизами и наличниками с разорванными фронтонами. Трапезная и колокольня, выполненные в стиле классицизма, дополняют архитектурный ансамбль.
