Строительство храма было инициировано в начале XIX века в связи с присвоением Мышкину статуса города в 1777 году и разработкой нового плана застройки, предусматривающего возведение собора, доминирующего над остальными зданиями.
Закладка храма состоялась 15 августа 1805 года на средства горожан и купцов Козьмы Ивановича Дрожденкова и Ивана Андроновича Замяткина. Проект собора был разработан итальянским архитектором Иоганнесом Манфрини. Строительство велось артелью ярославских каменщиков и завершилось в 1820 году.
Архитектурно собор представляет собой пятиглавый храм с трехъярусной колокольней. Центральный купол пологий, окружен четырьмя малыми главами, вырастающими из круглых башенок храма; еще одна глава украшает колокольню. Фасады оформлены портиками ионического ордера с треугольными фронтонами. В интерьере храма акустику обеспечивают четыре полые колонны.
В 1829–1832 годах артелью известного крепостного художника Тимофея Медведева были выполнены росписи стен храма в технике гризайль, изображающие сцены из Нового и Ветхого Завета, а также имитации архитектурных элементов — карнизов, колонн и лепнины. Позже в храме появились витражные окна.
Соборная площадь впоследствии застраивалась зданиями в классическом стиле, создавая с Успенским собором единый архитектурный ансамбль. Многие из этих зданий сохранились до сегодняшних дней.
В 1917 году Успенский собор был закрыт. Колокола были разбиты, на колокольне соорудили водонапорную башню, в храме разместили склад. В 1992 году собор вернули верующим. К 2009 году завершились основные работы по его реставрации. В одном из ярусов колокольни открыто древлехранилище, где можно увидеть старинные церковные облачения.
