Строительство храма датируется 1766–1769 годами и было осуществлено на средства петербургского купца первой гильдии Александра Петровича Березина, уроженца Ярославской губернии. Березин, родившийся в селе Еремейцево неподалёку от Мышкина, проявил инициативу в возведении храма после возвращения семейной иконы Николая Чудотворца, заложенной его отцом. В благодарность за это событие он финансировал строительство церкви.
В 1777 году, во многом благодаря усилиям А.П. Березина, Мышкин получил статус города. С 1778 года Никольская церковь была преобразована в городской собор и сохраняла этот статус до начала XIX века.
Архитектурно собор представляет собой образец храмового зодчества XVIII века. Он был возведён на возвышенности, что придаёт ему величественный вид. Здание выполнено в традициях русской православной архитектуры того периода, однако конкретное авторство проекта остаётся неизвестным. Существует версия, что проект мог быть подготовлен архитектором П.Я. Паньковым.
В 1820–1830-х годах собор подвергся реконструкции, в ходе которой были внесены изменения в его архитектурный облик. В частности, были обновлены некоторые элементы фасада и интерьера, что отразило стилистические тенденции того времени.
В советский период, как и многие религиозные учреждения, Никольский собор пережил сложные времена. В 1930-х годах он был закрыт, и его здание использовалось для различных хозяйственных нужд, что привело к утрате многих элементов внутреннего убранства и внешнего декора.
В конце XX века, с началом процесса возвращения религиозных объектов Русской Православной Церкви, Никольский собор был передан верующим. Были проведены реставрационные работы, направленные на восстановление первоначального облика храма и его адаптацию для проведения богослужений.
