Храм Успения Пресвятой Богородицы в Торжке впервые упоминается в писцовой книге Потапа Нарбекова в 1625 году. В документе указано, что церковь была посвящена Успению Богородицы и святым мученикам Флору и Лавру, а её строительство осуществлялось на мирские средства. Первоначальный храм был деревянным.
Каменное здание церкви возведено в 1746 году на средства новоторжских купцов Морозовых, чьи усадьбы располагались у подножия холма, на котором построен храм. Храм двухэтажный: нижний престол освящён в честь Рождества Пресвятой Богородицы и служил зимним (тёплым) храмом, а верхний — в честь Успения Пресвятой Богородицы и использовался в летний период. Также имелся придел святых Флора и Лавра.
В 1814 году церковь подверглась перестройке, в результате которой приобрела черты русского классицизма. В 1849 году на средства купца Алексея Тетюхина проведено обновление верхнего храма, включавшее создание нового иконостаса с золочением червонным золотом и настенной росписи. В 1850 году храм обнесён каменной оградой с кованой решёткой, а с восточной стороны сооружена часовня.
В 1929 году храм был закрыт советскими властями. С 1943 года в его здании размещалась типография, где печаталась газета «Знамя ударника». В 2013 году храм возвращён Русской Православной Церкви, после чего в нём возобновлены богослужения. На момент возвращения здание требовало реставрации, которая продолжается в настоящее время.
Церковь Успения Пресвятой Богородицы является объектом культурного наследия федерального значения. Историческое название улицы, на которой расположен храм, — Успенская, в советский период переименована в улицу Володарского.