В конце XVI века на территории современной Переяславской слободы была основана деревянная церковь, освящённая в честь Усекновения главы Иоанна Предтечи. Вскоре, в 1628 году, был устроен придел во имя святителя Николая Чудотворца.
В 1712 году произошёл пожар, уничтоживший деревянный храм. Благодаря усилиям прихожан и благотворителей, в 1713 году была возведена новая деревянная церковь, освящённая в честь Знамения Пречистой Богородицы, с приделами Усекновения главы Иоанна Предтечи и святителя Николая Чудотворца.
Строительство каменного храма началось в 1757 году на средства прихожан и пожертвования. Архитектурный проект был выполнен в стиле позднего барокко, а освящение нового здания состоялось в 1766 году. Главный престол был посвящён иконе Божией Матери «Знамение», а боковые приделы — Усекновения главы Иоанна Предтечи и святителя Николая Чудотворца.
В 1888 году, с учётом увеличения числа прихожан, храм подвергся значительной перестройке. По проекту архитектора Степана Крыгина были расширены боковые приделы, пристроены дополнительные помещения к колокольне и построен переход, соединяющий второй ярус колокольни с хорами. Эти изменения придали храму современный облик, сохранив при этом его первоначальный стиль.
Интерьер храма украшен резным позолоченным иконостасом конца XIX века, выполненным в традициях XVI–XVII веков, а также росписями художника Я.Е. Епаничкова, датируемыми 1899 годом. Среди святынь храма особое место занимает икона «Знамение» (список XVI века с новгородского подлинника), а также распятие из разрушенного Страстного монастыря и икона мученика Трифона с частицей его мощей.
После революции 1917 года храм не был закрыт и продолжал функционировать. В нём сохранялись святыни из других разрушенных церквей, включая иконы и частицы мощей святых. В 1929 году был освящён приставной престол во имя мученика Трифона, изготовленный из 250-летнего дуба. В 1979 году храм подвергся внешнему ремонту, а в начале 1980-х годов был построен новый церковный дом. В 1997 году был освящён каменный крестильный храм во имя священномученика Александра Хотовицкого.
Архитектурно, храм представляет собой одноглавое здание в форме квадрата с верхним ярусом и куполом. Восточная часть трапезной включает хоры на втором этаже. Колокольня трёхъярусная, четырёхугольная, гармонично дополняющая общий ансамбль.
