Строительство церкви началось в 1734 году по указу цесаревны Елизаветы Петровны на месте ранее сгоревшей деревянной Успенской церкви. Проект храма был разработан архитектором Иваном Яковлевичем Бланком при участии Михаила Григорьевича Земцова. Строительство продолжалось до 1747 года, когда церковь была завершена и освящена.
Архитектурный облик храма выполнен в стиле петровского барокко. Здание представляет собой трёхнефную каменную базилику с одним куполом и деревянной колокольней. Фасады окрашены в охристый цвет с белыми пилястрами, что придаёт сооружению выразительность и торжественность. С западной стороны к храму примыкает небольшой четырёхколонный портик с балконом, на ограде которого можно увидеть вензель Екатерины II.
В мае 1747 года, незадолго до освящения храма, в него была перенесена чудотворная икона Божией Матери «Знамение» из Санкт-Петербурга. Перенесение иконы сопровождалось крестным ходом, в котором участвовала сама императрица Елизавета Петровна, лично неся образ на некоторых участках пути. Икона была установлена над царскими вратами главного иконостаса и оставалась там до 1831 года.
12 мая 1820 года в Царскосельском дворце произошёл пожар, угрожавший распространением на соседние здания, включая Знаменскую церковь. Икону Божией Матери «Знамение» вынесли из храма и обратили ликом к месту пожара. Согласно свидетельствам, после этого ветер изменил направление, и пожар был остановлен. Император Александр I, присутствовавший при этом, воскликнул: «Матерь Божия, спаси мой дом!»
В период с 1811 по 1843 год церковь регулярно посещали воспитанники Царскосельского лицея, среди которых был Александр Сергеевич Пушкин. Храм играл важную роль в духовном воспитании лицеистов и был частью их повседневной жизни.
В 1941 году, во время Великой Отечественной войны, немецкие войска оккупировали Царское Село и похитили икону Божией Матери «Знамение». В 1944 году икона была обнаружена в Риге и возвращена в храм.
С 1943 по 1991 год храм был закрыт, и его здание использовалось не по прямому назначению. В 1991 году церковь была возвращена Русской Православной Церкви и вновь открыта для богослужений. В настоящее время Знаменская церковь является действующим храмом, приписанным к Екатерининскому собору Санкт-Петербургской епархии.
В интерьере храма особое место занимает икона преподобного Серафима Саровского в серебряном окладе, переданная в церковь императором Николаем II. Этот образ является одной из святынь храма и привлекает многих верующих.
