Согласно преданию, в 1382 году, во время нашествия хана Тохтамыша, великая княгиня Евдокия, супруга Дмитрия Донского, укрылась от преследования на Плещеевом озере. В благодарность за чудесное спасение она основала деревянную церковь в честь Рождества Иоанна Предтечи. Первое письменное упоминание об этом храме относится к началу XVI века и содержится в житии преподобного Даниила.
К 1628 году на этом месте уже существовала церковь Рождества Иоанна Предтечи. Во времена Петра I, когда рядом находилась верфь для строительства Переславской флотилии, храм получил прозвище «при кораблях». В 1788 году, по инициативе вдовы майора Анны Ивановны Масловой, обветшавшая деревянная церковь была заменена каменным храмом. Новый храм имел два престола: главный — в честь иконы Божией Матери «Знамение», и придельный — в честь Рождества Иоанна Предтечи.
В 1863 году при Знаменской церкви была открыта первая в Переславле церковно-приходская школа, основанная диаконом Воскресенским. Школа просуществовала несколько десятилетий, обучая местных жителей грамоте.
В 1929 году храм был закрыт, а в 1935 году здание церкви было полностью разрушено. На его месте в 1960-х годах был построен винный магазин, функционировавший до 1998 года.
В 1998 году началось восстановление храма на его историческом месте. Строительство велось по проекту архитектора Вячеслава Николаевича Ижикова и завершилось в 2004 году. Новый храм выполнен в стиле русской архитектуры XVII века, представляет собой пятиглавый четверик с трапезной и шатровой колокольней. Внешние стены украшены мозаикой, а звонница оснащена девятью колоколами.
В настоящее время Знаменская церковь является действующим православным храмом. Богослужения проводятся по выходным и праздничным дням. Престольные праздники отмечаются 7 июля (Рождество Иоанна Предтечи), 17 июля (память святых царственных страстотерпцев) и 10 декабря (иконы Божией Матери «Знамение»).
