Открытие Донской духовной семинарии состоялось 1 октября 1868 года в Новочеркасске. Инициатором её создания выступил архиепископ Донской Платон (Городецкий), действовавший в рамках реформы духовного образования, проводимой императором Александром II. Семинария была основана на основе нового Устава духовных семинарий, утверждённого 14 мая 1867 года, с учётом местных особенностей и потребностей. Первоначально занятия проходили в арендованном частном доме.
В 1883 году семинария получила новое здание на Платовском проспекте, построенное по проекту архитектора А. А. Ященко. В этом же году была освящена домовая церковь во имя апостола Иоанна Богослова, расположенная на втором и третьем этажах центральной части здания. В 1885 году при семинарии был открыт класс иконописания, а в 1888 году — Иоанно-Богословское общество. 7 мая 1887 года семинария принимала императора Александра III с семьёй. К началу XX века в ней обучалось более 500 семинаристов.
После Октябрьской революции 1917 года деятельность семинарии была прекращена. В 1920 году она была преобразована в пастырские курсы, а в 1921 году окончательно закрыта. Здание семинарии использовалось под различные нужды, включая размещение детской трудовой колонии.
Попытки возродить семинарию предпринимались в послевоенные годы, однако они не увенчались успехом. Лишь 6 октября 2010 года решением Священного Синода Русской Православной Церкви Ростовское миссионерское духовное училище было преобразовано в Донскую духовную семинарию. 23 ноября того же года состоялось торжественное открытие возрождённой семинарии в учебном корпусе на подворье Серафимовского храма на улице Портовой в Ростове-на-Дону.
В настоящее время Донская духовная семинария располагается по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Всесоюзная, 196. Здание семинарии представляет собой современное учебное сооружение, включающее учебные аудитории, библиотеку, домовый храм и другие необходимые помещения. Архитектурный облик здания сочетает традиционные элементы православного зодчества с современными строительными решениями.
Семинария реализует образовательные программы бакалавриата и магистратуры по направлению подготовки «Теология», а также программы подготовки регентов, иконописцев и другие. 5 апреля 2022 года Донская духовная семинария получила государственную лицензию на ведение образовательной деятельности по программе ФГОС 48.03.01 «Теология» (бакалавриат). 16 апреля 2024 года Федеральная служба по надзору в сфере образования и науки аккредитовала семинарию в отношении уровня высшего образования — бакалавриат по направлению подготовки 48.03.01 «Теология», предоставив право выдавать выпускникам дипломы государственного образца.
