Согласно преданию, в 1383 году на берегу реки Тихвинки произошло явление иконы Божией Матери, известной как Тихвинская икона. В последующие годы на месте явления были возведены несколько деревянных церквей, которые неоднократно страдали от пожаров. В период с 1507 по 1515 годы, по указу великого князя Московского Василия III, на месте сгоревших деревянных храмов был построен каменный Успенский собор, ставший первой каменной постройкой на территории Тихвинского посада. Собор был возведен по образцу Успенского собора Московского Кремля и предназначался для хранения чудотворной Тихвинской иконы Божией Матери.
В 1560 году, по указу царя Ивана IV Грозного, на левом берегу реки Тихвинки был основан Тихвинский Богородичный Успенский мужской монастырь. Руководство строительством было поручено новгородскому строителю Фёдору Сыркову. Монастырь был задуман как укрепленный пункт на северо-западных границах Руси, что обусловило его фортификационные особенности.
В период Смутного времени, в 1613 году, монастырь подвергся осаде со стороны шведских войск. Несмотря на длительную осаду, обитель устояла, что было отражено в литературном памятнике середины XVII века «Сказание об осаде», созданном тихвинским иконописцем Родионом Сергиевым.
Во второй половине XVII века на территории монастыря были возведены дополнительные постройки, включая келейные корпуса: Архимандричьи кельи (1682—1684), Келарские кельи (1684—1685), Евфимиевские палаты (Патриаршие кельи, 1699—1700), Казённые кельи (Архиерейский корпус, 1699), а также поварня конца XVI века. Почти все они приобрели нынешний облик в результате реставрационных работ XX—XXI веков.
В 1791 году в верхнем ярусе Введенской воротной башни была устроена надвратная церковь во имя чудотворной Тихвинской иконы Божией Матери. Изображение этой иконы расположено на западном фасаде башни.
. Однако после революционных событий 1917 года обитель была закрыта, а её помещения использовались для различных светских нужд. С 1968 года в монастырском комплексе размещался историко-краеведческий музей.
В 1995 году монастырь был возвращен Русской Православной Церкви, после чего начались масштабные реставрационные работы. В 2004 году в обитель была возвращена чудотворная Тихвинская икона Божией Матери, которая ранее находилась в Чикаго.
