Это одно из древнейших каменных зданий города, сохранившееся до наших дней.
Храм был построен в 1564 году на средства московского купца Гаврилы Андреевича Тушинского, переселённого в Тверь по указу царя Ивана IV. Первоначально на этом месте находилась деревянная церковь, которая была заменена каменным сооружением. Согласно надписи на западной стене храма, строительство завершилось 15 августа 1564 года. Храм был освящён в честь Пресвятой Троицы и приписан к Троице-Сергиевой лавре.
Архитектурно собор представляет собой четырёхстолпный одноглавый храм с тремя апсидами. В XVII веке были добавлены шесть малых глав, что придало зданию характерный семиглавый облик. В 1787 году с юго-западной стороны был пристроен придел во имя преподобного Ефрема Новоторжского. В 1812 году была возведена двухъярусная колокольня, а в 1878 году над ней появился третий ярус с шатровым завершением. В 1864–1867 годах был построен придел во имя святителя Арсения Тверского и мученицы Татианы. Иконостас храма датируется XVIII веком, а настенная живопись — концом XVIII — серединой XIX веков.
После перепланировки Затьмачья в 1777 году церковь оказалась недалеко от границы города. Позднее вокруг храма сформировалась площадь на пересечении двух улиц, названная Троицкой площадью, а улица, ведущая к Кремлю, получила название Троицкой. В советский период, после закрытия и уничтожения Спасо-Преображенского кафедрального собора, церковь Белая Троица с 1944 по 1990-е годы исполняла функции кафедрального собора Тверской епархии. В этот период храм не закрывался и оставался единственным действующим православным храмом в городе.
