Первоначально на месте нынешнего собора существовал храм, известный как Воздвиженский, с приделом в честь чудотворной иконы святителя Николая. В документах 1596—1598 годов он упоминается именно под этим названием. Впоследствии храм приобрёл статус соборного и стал известен как Никольский собор.
В 1779 году начались работы по перестройке надвратного храма, однако из-за выявленных трещин и ветхости сооружения работы были приостановлены.
Основные преобразования собора начались в 1802 году, когда священник Григорий Ильин и купец Пётр Маргорин получили разрешение использовать материалы от разбираемой Можайской крепости для перестройки собора. Автором проекта обновлённого здания стал архитектор Алексей Никитич Бакарев, ученик М. Ф. Казакова. В ходе строительства в собор были интегрированы фрагменты крепостной стены и главной проездной башни, что придало сооружению уникальные архитектурные черты.
Строительство собора продолжалось с перерывами и было завершено к 1814 году. Здание выполнено в псевдоготическом стиле, характерном для русской готики того периода. Расположенное на высоком кремлёвском холме, оно заметно издалека при подъезде к городу с западной стороны по Старой Смоленской дороге.
Во время Отечественной войны 1812 года недостроенный собор пострадал, однако деревянная скульптура Николы Можайского и церковная утварь, спрятанные в подвалах, уцелели. После войны строительство было завершено, и собор стал центральным храмом города.
В апреле-мае 1922 года из собора были изъяты риза и митра с иконы Николы Можайского. В 1933 году Никольский собор был закрыт, а резная икона Николы увезена в Третьяковскую галерею, где и хранится по сей день.
В период Великой Отечественной войны здание собора пострадало. После войны в 1960-х годах собор был восстановлен без купольной ротонды и использовался в качестве трикотажной фабрики. Лишь в 1980-х годах его передали в ведение Государственного Бородинского военно-исторического музея.
С 1994 года в соборе возобновились богослужения, и он вновь стал действующим храмом, продолжая служить духовным центром для жителей Можайска и окрестностей.