В 1895 году было принято решение о возведении нового храма на Мироносицком кладбище. Проект разработал губернский инженер Александр Гаврилович Старжинский, известный своими работами в русском национальном стиле. Строительство велось на средства горожан при активном участии настоятеля протоиерея Григория Николаевича Феликсова и церковных старост, включая купцов М. Е. Ивановского, С. Л. Тюрина и мещанина А. Д. Гуторова. В 1905 году храм был достроен и освящён: 1 мая — главный престол во имя Успения Божией Матери, 15 мая — левый придел во имя святителя Алексия Московского, 19 июня — правый придел во имя святых Жён-Мироносиц.
Архитектурно собор представляет собой пятиглавый храм с тремя полукруглыми апсидами с восточной стороны и небольшой звонницей с западной. Стиль постройки соответствует традициям русского национального зодчества, характеризующегося уравновешенностью масс и умеренным использованием декоративных элементов, что придаёт сооружению торжественность и монументальность.
После революции 1917 года храм был передан обновленческой общине. В 1937 году, после ареста служителей храма, он был закрыт и использовался как военный склад. 6 апреля 1945 года храм вновь открылся для верующих и вскоре стал кафедральным собором Пензенской епархии. С 1950 по 1953 год в нём были сооружены новые иконостасы. В 1970-х годах под южным приделом была устроена нижняя церковь во имя преподобного Серафима Саровского для совершения заупокойных богослужений.
В 1990-х годах рядом с собором был построен Благовещенский храм-крестильня по проекту архитектора Дмитрия Борунова, освящённый в 1994 году. В 1996 году было возведено административное здание, включающее кабинет настоятеля, воскресную школу, трапезную, ризницу, конференц-зал, общежитие и комнату отдыха для священника. 2 октября 1999 года в связи с 200-летием Пензенской епархии собор посетил Святейший Патриарх Московский и всея Руси Алексий II. 22 октября 2000 года в собор были перенесены мощи святителя Иннокентия Пензенского, пребывавшие там до 17 октября 2021 года.