С течением времени деревянный храм стал недостаточным для растущего населения города. В начале 1590-х годов, по благословению патриарха Иова, было принято решение о строительстве нового каменного собора. Руководителем работ назначили игумена Феодосия. К 1602 году строительство было завершено, и храм был освящен в честь Успения Пресвятой Богородицы. Этот выбор названия отражал особый статус Астрахани, считавшейся «младшей сестрой» Москвы, где главный собор также носил имя Успенского.
К концу XVII века каменный собор обветшал, что побудило митрополита Савватия инициировать сбор средств на возведение нового храма. Ему удалось собрать около 10 000 рублей, однако после его кончины в 1696 году средства были переданы в гражданское ведомство. Его преемник, митрополит Сампсон, получил из этих средств лишь 3 996 рублей, которых хватило на разборку старого собора и подготовку материалов для нового строительства. Не получив поддержки от правительства, митрополит обратился к местному купечеству, чьи щедрые пожертвования позволили начать строительство.
В 1699 году к работам приступила артель из тридцати каменщиков под руководством зодчего Дорофея Мякишева. Первоначальный проект предполагал возведение собора с одним большим куполом. Однако в 1702 году, из-за поспешности кладки или недостаточной прочности связей, свод храма обрушился. В результате было принято решение о строительстве пятикупольного собора, что придало ему иной архитектурный облик.
Строительство продолжалось с перерывами, вызванными, в частности, стрелецким восстанием 1705–1706 годов, в котором участвовали многие строители собора. В 1707 году нижний храм был освящен в честь Владимирской иконы Божией Матери, а в 1708 году в нем был возобновлен придел во имя святителей Афанасия и Кирилла Александрийских. В 1709 году сильный пожар повредил почти завершенный собор, обгорели главы храма. Несмотря на эти трудности, основные каменные работы были завершены к 1710 году, и 14 августа того же года верхний храм был освящен в честь Успения Пресвятой Богородицы.
Архитектурно собор выполнен в стиле московского барокко и представляет собой двухэтажное пятикупольное сооружение с кубическим объемом. Фасады украшены тонкой белокаменной резьбой и фасонным кирпичом более ста видов. С восточной стороны к основному объему примыкает алтарь с пятью апсидами, а с западной — лобное место с широкой двухмаршевой лестницей. Внутреннее убранство отличалось восьмиярусным иконостасом высотой 32 аршина (около 22,7 метра), созданным нижегородскими мастерами Иваном Тимофеевым и его сыном Терентием.
После установления советской власти в 1918 году собор был закрыт для богослужений. В последующие годы здание использовалось для различных нужд: склад боеприпасов, казармы для военнослужащих, музей краеведения. В 1931 году были уничтожены уникальный иконостас и соборные иконы; галерея была разрушена в 1930-х годах. С 1958 года собор и часть зданий Астраханского кремля были переданы в ведение Управления культуры облисполкома, около 1970 года была проведена реставрация собора. В 1974 году собор был передан Астраханскому краеведческому музею.
После распада СССР собор был возвращен Русской Православной Церкви. 7 января 1992 года в нижнем храме прошло первое богослужение после долгого перерыва. В последующие годы проводились реставрационные работы, направленные на восстановление внутреннего убранства и архитектурных элементов собора. В 2009 году состоялось великое освящение верхнего храма.
