В 1960 году, после закрытия Татианинской церкви, единственного действующего на тот момент храма в Стерлитамаке, православная община приобрела жилой дом на Выселках, где был организован Николо-Татианинский молитвенный дом. В этом помещении богослужения проводились до 1988 года.
В 1986 году архиепископ Уфимский и Стерлитамакский Анатолий получил разрешение на строительство нового храма. Для этих целей были выкуплены земельные участки, на которых находились жилые строения; после их сноса была подготовлена территория под строительство. Строительство велось в период с 1986 по 1988 годы, и в 1989 году здание церкви было введено в эксплуатацию. В 1996 году была проведена реконструкция собора.
В марте 1998 года на территорию Никольского собора был переведен Крестовоздвиженский женский монастырь из Уфы, получивший новое название — Благовещенский женский монастырь. С этого времени собор стал не только главным храмом города, но и монастырским.
В 2006 году были проведены работы по утеплению купола, приобретены новые паникадила и колокола. Спустя более чем 20 лет эксплуатации стало очевидно, что здание нуждается в капитальном ремонте из-за появления трещин, вызванных особенностями грунта. Богослужения временно перенесли в расположенный рядом крестильный храм в честь святого великомученика Феодора Стратилата. В ходе масштабной реконструкции, завершившейся в 2016 году, собор претерпел значительные изменения: было установлено монолитное основание, возведены пять новых куполов, увеличена площадь храма, появились четыре башни, проведены работы по внутренней отделке и фасаду.
В ноябре 2019 года собору была передана икона святых Вифлеемских младенцев с частицей мощей одного из них.
