Первое упоминание о церкви на этом месте датируется 1548 годом, когда в Лицевом летописном своде Ивана Грозного упоминается деревянная церковь Вознесения Господня. В 1629 году эта постройка была уничтожена пожаром. В 1634 году на её месте возведена каменная церковь, ставшая центром Новгородской слободы, где проживали выходцы из Новгорода и Великого Устюга. В 1680-х годах к храму был пристроен южный придел во имя святых Прокопия и Иоанна Устюжских, а в 1690 году упоминается северный придел святителя Николая.
В 1737 году храм пострадал от пожара и был восстановлен к 1739 году. В ходе реконструкции северный придел был переосвящён в честь Усекновения главы Иоанна Предтечи. В 1764 году церковь надстроена восьмиугольным барочным барабаном с одной главой. В начале XIX века расширен южный придел, сооружена арочная галерея, примыкающая к северному приделу, и построена тёплая паперть. В 1831 году установлен новый иконостас. В 1876 году проведена перестройка по проекту архитектора Алексея Мартынова, а в 1902 году — реставрационные работы.
После революции 1917 года храм продолжал действовать, однако в 1929 году с него были сняты колокола, отправленные на переплавку. В 1937 году церковь закрыта, кресты сняты, внутренние помещения переоборудованы. В 1980 году здание использовалось одним из управлений Главмосстроя. В 1992 году храм возвращён Русской Православной Церкви, и 3 июня того же года, в праздник Вознесения Господня, главный престол освящён. Росписями храма занимались художники Ирина Старженецкая и Иван Глазунов, иконостасы выполнены иконописцем Сергеем Фёдоровым.
