Храм Вознесения Господня в Задонском Рождество-Богородицком монастыре был построен в 1817 году как часть монастырского комплекса. Первоначально он служил больничной церковью и располагался на втором этаже южного корпуса. В 1862 году здание перестроили, вынеся алтарную часть наружу на место разобранной Митрофаньевской часовни.
Монастырь, в состав которого входил храм, основан в 1610 году монахами Кириллом и Герасимом из московского Сретенского монастыря. Они принесли с собой список Владимирской иконы Божией Матери, ставший главной святыней обители. В 1692 году пожар уничтожил первоначальные деревянные постройки, но икона чудесным образом сохранилась.
В XVIII веке монастырь пережил период расцвета, связанный с пребыванием здесь святителя Тихона Задонского. В это время велось активное каменное строительство. Храм Вознесения Господня появился в рамках масштабной перестройки монастырского комплекса в начале XIX века.
После революции 1917 года монастырь был закрыт, а его здания использовались для светских нужд. Возрождение обители началось в 1990 году. В ходе реставрационных работ храм Вознесения Господня был восстановлен в своем историческом виде. В настоящее время он является действующим и входит в состав архитектурного ансамбля Задонского Рождество-Богородицкого монастыря.