Первоначально на этом месте находился деревянный однопрестольный храм, антиминс для которого был освящён архиепископом Феодосием в 1693 году.К 1767 году на его месте была возведена новая трёхпрестольная деревянная церковь с приделами во имя Архистратига Михаила и Благовещения Пресвятой Богородицы.
В 1812 году, во время Отечественной войны, город Мглин избежал разграбления наполеоновскими войсками. В знак благодарности за спасение города жители приняли решение о строительстве нового каменного собора. Инициатором строительства выступил коллежский асессор Григорий Лишин, пожертвовавший на начальные работы 10 000 рублей ассигнациями и почти такую же сумму векселями. Строительство началось в 1815 году и продолжалось 15 лет.
К 1825 году работы не были завершены из-за недостатка средств. В этом же году, во время пребывания императора Александра I в Мглине, жители обратились к нему с просьбой о финансовой помощи для завершения строительства. После смерти Александра I в 1825 году, его преемник, Николай I, в 1827 году выделил из царского кабинета 5 000 рублей ассигнациями на завершение строительства и приобретение колоколов. Осенью 1830 года отделочные работы были завершены, и 23 октября того же года собор был торжественно освящён.
Архитектурное решение собора выполнено в стиле позднего классицизма. Пятиглавый храм представляет собой двусветный четырёхстолпный четверик, фланкированный четырёхколонными тосканскими портиками с треугольными фронтонами. Отсутствие апсиды и трапезной подчёркивает монументальность сооружения. Внутреннее пространство перекрыто системой сводов, центральный объём завершён куполом на барабане, опирающемся на подпружные арки с парусами. В интерьере сохранились настенные росписи второй половины XIX века, выполненные масляной краской по штукатурке.
В 1929 году, после установления советской власти, с куполов собора были сняты кресты, а с южной колокольни — колокола. В 1930-х годах обе колокольни и кирпичная ограда были разобраны, что существенно изменило первоначальный облик собора. Однако основное здание не подверглось разрушению, и в 1943 году, после проведения ремонта, в соборе возобновились богослужения.
В 1961 году собор вновь был закрыт, и его здание использовалось не по назначению. 18 октября 1988 года было принято решение о передаче здания Успенского собора православной общине. Первое богослужение после длительного перерыва состоялось 14 октября 1989 года, в праздник Покрова Пресвятой Богородицы. В 1990-х годах рядом с собором была построена небольшая колокольня.