Троицкий храм в Задонске был построен как соборный храм Свято-Троицкого Тихоновского женского монастыря в период с 1884 по 1897 год. Освящение храма состоялось 12 августа 1897 года архиепископом Воронежским и Задонским Анастасием (Добрадиным). Храм возведен в русско-византийском стиле по проекту воронежского губернского архитектора Александра Антоновича Кюи. Первоначально монастырь, при котором был построен храм, возник из женской общины сестер милосердия, основанной Матроной Наумовной Поповой в середине XIX века.
История монастыря начинается с 1830-х годов, когда Матрона Попова, получившая исцеление у мощей святителя Тихона Задонского, организовала странноприимный дом для паломников. В 1860 году при общине была построена церковь в честь иконы Божией Матери «Всех скорбящих Радость», освященная епископом Воронежским Иосифом (Богословским). В 1880 году община получила официальный статус, а в 1888 году была преобразована в монастырь.
В 1920-х годах монастырь был упразднен советской властью. На его территории размещались детская колония, затем детский дом. Колокольня монастыря была разобрана до нижнего яруса в годы Великой Отечественной войны. В послевоенные годы здания монастыря использовались под хлебокомбинат и жилые помещения.
Троицкий храм был возвращен Русской Православной Церкви и открыт для богослужений в 1972-1973 годах. В 1974 году, после закрытия Успенского храма Задонска, Троицкий храм стал приходским. В 1990-х годах начались работы по восстановлению храма, а в 2007 году была завершена капитальная реставрация, включавшая обновление настенной росписи.
Архитектурно храм представляет собой пятикупольное сооружение с тремя престолами: главный придел освящен во имя Святой Троицы, правый — в честь Всех святых, левый — в честь преподобного Арсения Великого. Среди святынь храма особо почитаются икона Пресвятой Троицы с частицей от Мамврийского дуба, Иверская икона Божией Матери и икона святителя Тихона Задонского с частицей его мощей.