Храм святителя Митрофана Воронежского был основан в 1834 году по инициативе протоиерея Антония Инсарского, настоятеля Введенской церкви Пензы. В июне 1834 года он подал прошение епископу Пензенскому и Саранскому Иоанну I о строительстве каменной церкви на кладбище у деревни Тимаковки. Храм был заложен в том же году и освящен 22 октября 1836 года во имя святителя Митрофана Воронежского. В сентябре 1838 года завершилось строительство колокольни.
Первоначально церковь была приписана к Введенскому храму, и богослужения совершались в ней редко — не более десяти раз в год. В 1883 году купец Никифор Пособцев провел ремонт здания, а в 1890-х годах, по проекту епархиального архитектора Алексея Эренберга, храм был расширен за счет средств купца Епифанова. В трапезной части устроили два придела: правый — в честь Нерукотворного Образа Спасителя, левый — в честь Иверской иконы Божией Матери и святителя Феодосия Черниговского. Освящение левого придела состоялось 13 августа 1900 года.
В 1932–1933 годах в храме разместилась архиерейская кафедра Патриаршей Церкви, которая оставалась здесь до 1945 года. В период с 1937 по 1945 год Митрофановская церковь была единственным действующим храмом в Пензе, хотя и она временно закрывалась с ноября 1941 по январь 1942 года. В эти годы здесь служили епископ Феодор (Смирнов) и священники Василий Смирнов и Гавриил Архангельский, впоследствии канонизированные как новомученики.
В храме находится чудотворная Казанская икона Божией Матери, которая, по преданию, была подарена Пензе царем Алексеем Михайловичем. В 1717 году, во время Большого кубанского погрома, перед этой иконой молились о спасении города. В советский период икона хранилась в различных пензенских храмах, а в конце 1930-х годов была перенесена в Митрофановскую церковь.
На прилегающем кладбище погребены видные деятели Пензы: художники Константин Савицкий и Иван Горюшкин-Сорокопудов, ботаник Иван Спрыгин, композитор Александр Турищев, а также ряд священнослужителей. У левого придела храма похоронен епископ Кирилл (Поспелов), скончавшийся в 1953 году.