Храм Спаса Нерукотворного Образа в Зимнем дворце был заложен 14 октября 1753 года по проекту архитектора Франческо Бартоломео Растрелли. Строительство велось на месте прежней придворной церкви времён Анны Иоанновны, освящённой в 1735 году архиепископом Феофаном Прокоповичем. Отделка интерьера началась в 1759 году: купола расписывали итальянские мастера Карло Цукки и Франческо Мартини, алтарную часть — Джованни Венерони, лепные работы выполнил Джованни Баттиста Джани. Трёхъярусный иконостас создан по эскизам Растрелли резчиками Иваном Дункером и Луи Ролланом, иконы написаны Иваном Бельским с братьями и Иваном Вишняковым.
6 апреля 1762 года, при освящении Зимнего дворца, храм оставался недостроенным, и архиепископ Новгородский Димитрий (Сеченов) освятил временную Воскресенскую церковь. Окончательное освящение в честь Нерукотворного Образа Спасителя совершил 12 июля 1763 года архиепископ Санкт-Петербургский Гавриил (Кременецкий). Главной святыней стал образ Спаса кисти Феодота Ухтомского (1693), помещённый в молельной за алтарём.
В 1799 году в храм перенесли реликвии Мальтийского ордена: десницу Иоанна Предтечи, Филермскую икону Божией Матери и часть ризы Господней. С 1800 года в честь этого события установлен праздник 12 (25) октября. В 1837 году пожар уничтожил интерьеры, восстановлением которых занимался архитектор Василий Стасов. Иконостас воссоздан из папье-маше, живопись плафона выполнил Пётр Басин, роспись «под лепку» — Пьетро Медичи. Повторное освящение состоялось 25 марта 1839 года.
В 1918 году храм закрыт, помещение использовалось как склад. В 1939 году иконостас демонтировали для выставки западноевропейского фарфора. Реставрационные работы начались в 2008 году, к 2014 году интерьеры восстановлены. С 25 декабря 2014 года в храме возобновлены богослужения.