В 1370 году преподобный Феодор, племянник преподобного Сергия Радонежского, основал на этом месте деревянную церковь во имя Рождества Пресвятой Богородицы, положив начало Симонову монастырю. В 1379 году монастырь был перенесён на новое место, а первоначальная обитель осталась как скит и усыпальница для иноков, получив название Старое Симоново.
После Куликовской битвы 1380 года, в которой участвовали иноки Пересвет и Ослябя, их тела были погребены при церкви Рождества Пресвятой Богородицы в Старом Симонове. Впоследствии храм стал местом почитания этих воинов-иноков.
В 1509 году на месте деревянной церкви была построена каменная одноглавая церковь, освящённая в 1510 году митрополитом Симоном. Стены храма были сложены из крупных кирпичей, и первоначально он, вероятно, имел четырёхстолпную конструкцию.
В XVIII веке были обнаружены захоронения Пересвета и Осляби. В 1757 году по просьбе прихожан была построена новая колокольня над их усыпальницей. В 1785–1787 годах были возведены каменные трапезная и колокольня, а также устроен придел во имя святителя Николая.
В 1794 году императрица Екатерина II выделила средства на сооружение памятника Пересвету и Ослябе, который был установлен в трапезной церкви. В 1849–1855 годах по проекту архитектора Накиза Зборжевского трапезная и колокольня были перестроены, и в трапезной устроены два придела: святого Николая и святого Сергия.
В 1870 году, к 500-летию храма, были проведены работы по восстановлению первоначального облика здания, включая восстановление древних оконных проёмов и украшений. Также было установлено чугунное надгробие с сенью над предполагаемым местом захоронения Пересвета и Осляби.
В 1928 году храм был закрыт, а в 1932 году снесена колокольня. Чугунное надгробие было уничтожено, а здание храма использовалось под производственные нужды завода «Динамо», что привело к значительным разрушениям.
В 1987 году здание было передано Историческому музею, а в 1989 году возвращено Русской Православной Церкви. Храм был повторно освящён 16 сентября 1989 года. В 2006 году восстановлена колокольня, на которой установлен колокол «Пересвет» весом 2200 кг.
